ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標(biāo)準(zhǔn)品是三種腦脊液（腦脊液）認(rèn)證的參考物質(zhì)(CRMs)的一部分，其中包含不同水平的淀粉樣β1-42肽(Aβ1-42)。這三個(gè)crm(ERM-DA480/IFCC、ERMDA481/IFCC和ERM-DA482/IFCC)是在歐盟委員會(huì)聯(lián)合研究中心的責(zé)任下生產(chǎn)和認(rèn)證的。制備ERM-DA482/IFCC的起始材料是通過連續(xù)腰椎引流術(shù)從常壓腦積水患者中收集的人腦脊液。

制備工藝與定值技術(shù)

1. 生產(chǎn)質(zhì)控體系

遵循 JRC-IRMM 蛋白類參考物質(zhì)制備規(guī)范（IRMM/ENV 15144）及 ISO 17034 要求，核心流程聚焦 ABETA 42 的穩(wěn)定性與純度控制：

重組表達(dá)與純化：將ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標(biāo)準(zhǔn)品 ABETA 42 基因克隆至 pET-28a 載體，HEK293 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，采用鎳柱親和層析（His 標(biāo)簽純化）→ 離子交換層析（Q Sepharose）→ 凝膠過濾層析（Superdex 75）三步純化，SDS-PAGE 驗(yàn)證純度≥99%，HPLC 檢測聚集率＜1%；

基質(zhì)匹配與凍干：將純化 ABETA 42 與去蛋白腦脊液按比例混合，程控凍干（預(yù)凍 - 70℃，升華壓力 0.05 mbar，解析干燥 48 h），確保蛋白回收率≥92%，凍干后水分含量＜3%；

質(zhì)控驗(yàn)證：通過圓二色譜（CD）驗(yàn)證 ABETA 42 二級(jí)結(jié)構(gòu)（β 折疊含量＜10%，避免提前聚集），-80℃儲(chǔ)存穩(wěn)定性已驗(yàn)證 36 個(gè)月（濃度衰減≤4%），瓶間均勻性采用 LC-MS/MS 檢測（CV≤2.5%）。

2. 聯(lián)合定值方法

采用國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）推薦的 LC-MS/MS 參考方法，聯(lián)合 5 家國際權(quán)l(xiāng)威機(jī)構(gòu)（德國 BAM、法國 LNE、英國 NPL、美國 NIST、中國計(jì)量院）同步定值，核心流程：

樣品前處理：ERM-DA482 腦脊液中的ABETA 42標(biāo)準(zhǔn)品溶解后，加入 13C/15N 同位素標(biāo)記的 ABETA 42 內(nèi)標(biāo)（濃度 20 pg/mL），胰蛋白酶酶解（37℃，4 h），固相萃取（SPE，C18 柱）富集肽段；

LC-MS/MS 檢測：采用反相色譜柱（Acquity UPLC BEH C18，2.1×100 mm），流動(dòng)相為 0.1% 甲酸水 - 0.1% 甲酸乙腈，梯度洗脫（乙腈 0-40%，30 min），三重四極桿質(zhì)譜（AB Sciex QTRAP 6500）多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，監(jiān)測特征肽段（m/z 622.3→776.4，內(nèi)標(biāo) m/z 625.3→782.4）；

定值一致性與不確定度：5 家機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果相對(duì)偏差≤3.2%，不確定度主要來源于：酶解效率波動(dòng)（貢獻(xiàn) 35%）、質(zhì)譜響應(yīng)偏差（貢獻(xiàn) 28%）、基質(zhì)不均勻性（貢獻(xiàn) 20%），最終擴(kuò)展不確定度（k=2）為 5.2%-12.0%。

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